Методы дифференциальной окраски хромосом

Методы дифференциальной окраски хромосом

При окрашивании митотических хромосом ацидофильными (т. е. связывающимися с кислотами) красителями, например эо­зином, или неспецифическими к нуклеотидам флуоресцентны­ми красителями (флуорохромами — веществами, способными излучать световые волны большей длины при возбуждении светом с меньшей длиной волны) выявляется практически рав­номерный рисунок без исчерченности. Такая окраска называет­ся рутинной (рис. 27).

Если перед окрашиванием митотические хромосомы обра­ботать щелочными растворами, вымывающими ДНК в первую очередь из районов с низкой плотностью хроматина, можно на­блюдать интенсивное окрашивание прицентромерных районов всех хромосом и практически полное интенсивное окрашивание У-хромосомы (рис. 28). Такой подход называется С-методом дифференциального окрашивания хромосом или С-бендингом. С-положительные (интенсивно окрашенные при использовании этого метода) районы хромосом соответствуют участкам гене­тически инертного хроматина, или гетерохроматина. Различная степень окрашивания районов хромосом при С-окраске свиде­тельствует о неоднородности распределения гетерохроматина по длине хромосом.

Рис. 28. Митотические хромосомы человека, окрашенные по С-методу

(фото Е.Г. Нероновой)

В зависимости от степени плотности упаковки фибриллы 30 нанометров различают более конденсированный хроматин — гетерохроматин и менее конденсированный — эухроматин. Ге­терохроматиновые участки очень интенсивно окрашиваются при дифференциальной С-окраске хромосом из-за большей плотности и хорошо видны под микроскопом. ДНК, находящая­ся в гетерохроматине, не транскрибируется и содержит боль­шое количество повторяющихся последовательностей. На стадии интерфазы гетерохроматин часто располагается по пе­риферии ядра (пристеночный гетерохроматин). В эухроматине ДНК упакована сравнительно неплотно. Гены, находящиеся в эухроматиновых районах, активно транскрибируются. Плот­ность упаковки хроматина зависит от модификаций гистонов (метилирования, ацетилирования, фосфорилирования), в пер­вую очередь это относится к гистону Н1. Гетерохроматин у млекопитающих состоит преимущественно из высокоповто­ряющейся ДНК с высоким содержанием АТ-пар оснований. Таким образом, С-окраска позволяет выявлять наиболее раз­личающиеся по своему составу и плотности районы хромосом.

Если обработку перед окрашиванием проводить более мяг­ко, можно обнаружить поперечную исчерченность митотических хромосом. Это дифференциальная G-окраска или G-бендинг (рис. 29). G-положительные районы соответствуют более ком­пактизованным, менее насыщенным генами участкам хромо­сом, которые содержат количество АТ-пар большее, чем G-отрицательные районы. Как правило, в G-положительных районах ^+-блоках) находятся тканеспецифические и стадиес­пецифические гены, транскрипция которых нужна не во всех клетках. В этом заключается биологическое значение блочной организации хромосом — гены, которые одинаково нужны во всех клетках, находятся в более деконденсированных участках хромосом, где ДНК более доступна для ферментов транскрип­ции. Для получения отчетливой G-окраски обычно используют мягкую обработку хромосом раствором трипсина с последую­щим окрашиванием красителем Романовского-Гимзы. По об­щепринятой трехбуквенной номенклатуре, которая часто используется в записи цитогенетического диагноза, такая окра­ска обозначается GTG ^-окраска — трипсин — Гимза).

G+-блоки также могут быть выявлены при окрашивании хромосом АТ-специфическими флуорохромами рАР1, Хехст 33258) — это дифференциальная Q-окраска или Q-бендинг (рис. 30). АТ-богатые G-положительные районы связывают большее количество красителя, что приводит к их более интен­сивной флуоресценции. Использование этого метода позволяет идентифицировать У-хромосому даже в интерфазе, поскольку значительная ее часть состоит из необычайно АТ-богатого гетерохроматина, который при связывании с флуорохромами дает бриллиантовое свечение.

Рис 30. Митотические хромосомы человека, окрашенные по Q-методу

Рисунок, обратный G-бендингу, получается при помощи R-метода дифференциального окрашивания путем тепловой денатурации (рис. 31). ГЦ-пары, которых больше в G-отрицательных районах хромосом, более устойчивы к этой процедуре. Подавляющее большинство G+^айонов соответст­вует R- и наоборот (рис. 32). Само название этого метода про­исходит от английского слова reversed — обратный. R+-районы реплицируются в первой половине фазы S клеточного цикла, а G+-районы — во второй. Существуют методики выявления

R-бендинга путем введения в клетки модифицированных предшественников синтеза ДНК в середине фазы S. Тогда R+-районы не будут содержать модифицированных нуклеоти­дов, а G+-районы — будут.

При более интенсивной тепловой обработке выявляются Т-сегменты, расположенные преимущественно в прителомер- ных районах хромосом (рис. 33). Их локализация совпадает с наиболее близкими к теломере R-сегментами (рис. 32). Содер­жание генов в Т+-районах на порядок больше, чем в среднем по длине хромосомы, и больше чем в относительно обогащен­ных генами R+-районах. Некоторые функциональные особен­ности позволяют считать Т-сегменты наиболее выраженными R-сегментами. В таких районах находится особенно много ге­нов, связанных с наиболее важными функциями жизнеобеспе­чения клетки — генов домашнего хозяйства и онкогенов, мутация которых может привести к злокачественной опухоли. Это определяет особое значение теломерных районов в онко­генезе.

Районы ядрышковых организаторов (ЯОР), содержащих ге­ны рибосомной РНК и формирующих в интерфазе ядрышки, могут быть выявлены при помощи окраски нитратом серебра (AgNO3). Такой тип окраски называется N-бэндинг.

Для обозначения хромосомы человека используется аб­бревиатура HSA (от латинского видового названия Homo sapiens) и цифра, соответствующая номеру хромосомы. На­пример, HSA21 — хромосома 21 человека. В клинической прак­тике обозначение HSA иногда опускают, поскольку ясно, что речь идет о человеке. Для удобства определения отдельных районов хромосом их обозначают числами, как показано на рис. 34. Последняя цифра числового обозначения указывает на определенный бэнд — полоску, выявляемую при дифферен­циальном окрашивании, первая цифра указывает на условную часть хромосомы, состоящую из нескольких бэндов. По умол­чанию приводят обозначения сегментов, выявляемых G-методом. Теломеры обозначаются ter, длинное и короткое плечи — q и p соответственно.

Примеры:

HSA14p11 — район 11 короткого плеча хромосомы 14 человека;

HSAXqter — теломер длинного плеча Х-хромосомы человека;

5pter-p11 — участок, ограниченный теломером и бендом 11 короткого плеча хромосомы 5 (включает 5p11,5p12, 5p13, 5p14, 5p15.1, 5p15.2 и 5p15.3) (рис. 34).

Рис. 34. Схема обозначения районов хромосом на примере хромосомы 5 человека (HSA5), дифференциально окрашенной по G-методу (уровень разрешения 400 сегментов на кариотип)

Для повышения точности цитогенетического анализа часто используют прометафазные и даже профазные хромосомы, что позволяет увеличить число распознаваемых сегментов диффе­ренциального окрашивания до 850 и 1700 соответственно.



Источник: medinfo.social


Добавить комментарий