Классификация вирусов понятие вируса и вириона

Классификация вирусов понятие вируса и вириона

Морфология и ультраструктура вирусов.

Индикация вирусной репродукции.

Серологические реакции в вирусологии.

 

Современная вирусология представляет собой бурно разви­вающуюся отрасль естествознания, оказывающую большое влия­ние на развитие многих медико-биологических и клинических дисциплин. Изучение механизмов репродукции вирусов показало возможность их воспроизведения только из одной нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК- Открытие и последующее изучение явлений лизогении и вирогении, свидетельствующих о возмож­ности сохранения вирусной информации и передаче ее потомству, потребовало пересмотра сложившихся понятий о механизмах формирования, персистирующих инфекций и онкологических за­болеваний. Открытие нового вируса иммунодефицита человека ВИЧ доказало возможность образования новых видов, вызываю­щих определенные нозологические формы инфекций человека в современных условиях. Вместе с тем в области общей вирусоло­гии продолжает оставаться ряд нерешенных проблем, связан­ных с происхождением, генетикой и молекулярной биологией вирусов, изысканием путей химиотерапии вирусных инфек­ций и т. д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ

Стремительные темпы развития вирусологии во второй поло­вине нашего столетия позволили получить важнейшие сведения  о структуре и химическом составе разных вирусов, в том числе их генома, а также о характере взаимодействия с клетками хозяев.

Полученные материалы свидетельствуют о том, что вирусы существуют, в двух качественно разных формах: внекле­точной — в и р и о н  и  в н у т р и к л е т о ч  н о й — в и р у с. Вирион наиболее простого вируса представляет собой нуклеопро-теид, в состав которого входит вирусный геном, защищенный белковой оболочкой — капсидом. В то же время внутрикле­точный вирус есть самореплицирующаяся форма, не способная к бинарному делению. Тем самым в определение вируса закла­дывается принципиальное различие между клеточной формой микроорганизмов, размножающихся бинарным делением, и реп­лицирующейся формой, воспроизводящейся только из вирусной нуклеиновой кислоты. Однако качественное отличие вирусов от про- и эукариот не ограничивается только одной этой стороной, а включает ряд других: 1) наличие одного типа нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК); 2) отсутствие клеточного строения и белоксинтезирующих систем; 3) возможность интеграции в клеточный геном и синхронной с ним репликации.

Вместе с тем вирусы отличаются от обычных репликонов, ка­кими являются молекулы ДНК всех микроорганизмов и любых других клеток, а также плазмид и транспозонов, поскольку упомянутые репликоны являются биомолекулами, которые нельзя отнести к живой материи.

Классификация и таксономия вирусов. Вирусы составляют царство Vira, которое подразделено по типу нуклеиновой кисло­ты на два подцарства — р и б о вирусы и дезоксирибо-вирусы. Полцарства делятся на семейства, которые в свою очередь подразделяются на роды. Понятие о виде вирусов пока еще четко не сформулировано, так же как и обозначение раз­ных видов.

В качестве таксономических характеристик первостепенное значение придается-типу нуклеиновой кислоты и ее молекуляр-но-биологическим признакам: двунитевая, однонитевая, сегменти­рованная, несегментированная, с повторяющимися и инверти­рованными последовательностями и др. Однако в практической работе прежде всего используются характеристики вирусов, по­лученные в результате электронно-микроскопических и иммуно­логических исследований: морфология, структура и размеры вириона, наличие или отсутствие внешней оболочки (суперкапсида), антигены, внутриядерная или цитоплазматическая локали­зация и др. Наряду с упомянутыми признаками учитываются резистентность к температуре, рН, детергентам и т. д.

В настоящее время вирусы человека и животных включены в состав 18 семейств (табл. 1,2). Принадлежность вирусов к определенным семействам определяется типом нуклеиновой кис­лоты, структурой, целостностью или фрагментацией генома, а также наличием или отсутствием внешней оболочки. При определении принадлежности к семейству ретровируеов обязательно учитывается наличие обратной транскриптазы.

Таблица 1.

Классификация ДНК-геномных вирусов

 

Семейство

вирусов

Наличие суперкап-

сида

Тип

симметрии

Размеры

(нм)

Структура

ДНК

Вирусы, имеющие важную  роль в патологии человека

Parvovirus

Нет

кубический

22

Однонитчастая, линейная

В 19 вирус

Papovavirus

Нет

кубический

55

Двунитчастая, циркулярная

Вирус папиломы

Adenovirus

Нет

кубический

75

Двунитчастая, линейная

Аденовирус

Hepadnavirus

Да

кубический

42

Двунитчастая, дефектна, циркулярная

Вирус гепатита В

Herpesvirus

Да

кубический

>100

Двунитчастая,

линейная

Вирус простого герпеса 1, 2, опоясывающего герпеса-ветрянки, цитомегаловирус, Эпштейна-Барр вирус

Poxvirus

Да

смешанный

250х400

Двунитчастая,

линейная

Вирус натуральной оспы, вирус вакцины

 

 

Описание: Описание: Описание: D:\++Kafedra\W E B - 2014\9\09 Морфология и ультраструктура вирусов.files\image002.jpg

Таблица 2.

Классификация РНК-геномных вирусов

Семейство

вирусов

Наличие суперкап-

сида

Тип

симметрии

Размеры

(нм)

Структура

ДНК

Вирусы, имеющие важную  роль в патологии человека

Picornavirus

Нет

кубический

28

Однонитчастая, линейная несегмен- тована, плюс

Полиовирус, риновирус, вирус гепатита А

Calicivirus

Нет

кубический

38

Однонитчастая, линейная, несегмен тированная, плюс

Вирус Норвалк, вирус гепатита Е

Reovirus

Нет

кубический

75

Двониткова, 10 сегментов

Реовирус, ротавирус

Flavivirus

Да

кубический

45

Однонитчастая, линейная несегмен тированная, плюс

Вирусы клищевого эн цефалита, японского энцефалита, желтой лихорадки, лихорадки Запад ного Нила, гепатита С

Togavirus

Да

кубический

60

Однонитчастая, линейная, 2 сегмен та, плюс

Вирус краснухи

Retrovirus

Да

кубический

100

Однонитчастая, линейная, несегмен тиро ванная, плюс

ВИЧ, вирус Т-клеточной лейкемии человека

Orthomyxovirus

Да

спиральный

80-120

Однонитчастая, линейная, 8 сегмен тов, минус

Вирусы гриппа

Paramyxovirus

Да

спиральный

150

Однонитчастая, линейная, несегментированная, минус

Вирусы парагриппа, кори, паротита, респира торно-синцитиальный вирус

Rhabdovirus

Да

спиральный

75х180

Однонитчастая, линейная, несегментированная, минус, минус

Вирус бешенства

Filovirus

Да

спиральный

80 >

Однонитчастая, линейная, несегментированная, минус, минус

Вирус Эбола, вирус Марбурга

Coronavirus

Да

спиральный

100

Однонитчастая, линейная, несегментированная, минус, плюс

Коронавирусы

Arenavirus

Да

спиральный

80-130

Однонитчастая, циркулярная, 2 сегмента, минус

Вирус лимфоцитарного хориоменингита

Bunyavirus

Да

спиральный

100

Однонитчастая, циркулярная, 3 сегмента, минус

Хантавирусы, вирус Кримской-Конго геморрагической лихорадки , вирус геморрагичной лихорадки сз почечным синдромом

Deltavirus

Да

невидомо

37

Однонитчастая, циркулярная, кольцо, минус

Вирус гепатита Д

Описание: Описание: Описание: D:\++Kafedra\W E B - 2014\9\09 Морфология и ультраструктура вирусов.files\image004.jpg

МОРФОЛОГИЯ И СТРУКТУРА ВИРИОНОВ

Размеры вирионов различных вирусов варьируют в широких пределах: от 15-—18 до 300—400 нм. Они имеют разнообразную форму: палочковидную» нитевидную, сферическую форму парал­лелепипеда, сперматозоидную.


Структура простого вириона — нуклеокапсида — свидетельствует о том, что вирусная нуклеиновая кислота — ДНК или РНК — надежно защищена белковой оболочкой — капсидом.(рис. 1.).

 

Описание: Описание: Описание: D:\++Kafedra\W E B - 2014\9\09 Морфология и ультраструктура вирусов.files\image006.jpg

Рис. 1.  Структура простого вируса

 

Последний имеет строго упорядоченную структуру, в основе которой лежат принципы спираль­ной или кубической симметрии. Капсиды палочковидных и нитевидных вирионов состоят из структурных субъединиц, уло­женных в виде спирали вокруг оси (рис. 2.). При таком расположении субъединиц обра­зуется полый канал, внутри которого ком­пактно уложена молекула вирусной нук­леиновой кислоты. Ее длина может во много раз превышать длину палочковид­ного вириона. Например, длина вируса табачной мозаики (ВТМ) 300 нм, а его РНК достигает величины 4000 нм, или 4 мкм. При этом РНК настолько связана с капсидом, что ее нельзя освободить, не повредив последний. Подобные капсиды встречаются у некоторых бактериальных вирусов и у вирусов человека (например, вируса гриппа).

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Helical         Описание: Описание: Описание: D:\++Kafedra\W E B - 2014\9\09 Морфология и ультраструктура вирусов.files\image010.jpg

Рис.2. Спиральный тип симметрии

Сферическая структура вирионов определяется капсидом, по­строенном по принципам кубической симметрии, в основе кото­рой лежит фигура икосаэдра — двадцатигранника (рис. 3.). Капсид сос­тоит из асимметричных субъединиц (полипептидных молекул), которые объединены в морфологические субъединицы — к а п с о м е р ы. Один капсомер содержит 2, 3 или 5 субъединиц, расположенных по соответствующим осям симметрии икосаэдра. В зависимости от типа перегруппировки и числа субъединиц число капсомеров будет равным 30, 20 или 12.

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Icosahedral

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Adeno_struct         Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Aden_stru02

 

Рис. 3. Кубический (икосаэдрический тип симметрии) вирусов. Структура капсида аденовируса

Вирионы со сложным капсидом, построенным более чем из 60 структурных субъединиц, содержат группы из 5 субъединиц — пентамеры, или из 6 субъединиц — гексамеры. Нуклеокапс и д сложноорганизованных вирионов, называемый «сердцеви­ной», покрыт внешней оболочкой — суперкапсидом(рис. 4.).


 

Описание: Описание: Описание: D:\++Kafedra\W E B - 2014\9\09 Морфология и ультраструктура вирусов.files\image018.jpg

Описание: Описание: Описание: D:\++Kafedra\W E B - 2014\9\09 Морфология и ультраструктура вирусов.files\image020.jpg

Рис. 4.  Структура сложного вируса

 

 

Описание: Описание: Описание: D:\++Kafedra\W E B - 2014\9\09 Морфология и ультраструктура вирусов.files\image022.jpg

Рис. 5. Смешанный тип симметрии вирусов (бактериофаги).

 

 

ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ВИРИОНОВ

В состав простых вирионов входит один тип нуклеиновой кис­лоты — РНК или ДНК — и белки. У сложных вирионов в составе внешней оболочки содержатся липиды и полисахариды, которые они получают из клеток хозяина.

Вирусные ДНК. Молекулярная масса ДНК разных вирусов колеблется в широких пределах (1 • 106—1 • 10 ). Она пример­но в 10—100 раз меньше молекулярной массы ДНК бактерий. В геноме вирусов содержится до нескольких сотен генов. По сво­ей структуре вирусные ДНК характеризуются рядом особен­ностей, что дает возможность подразделить их на несколько типов. К ним относятся двунитевые и однонитевые ДНК, кото­рые могут иметь линейную или кольцевую форму. Хотя в каж­дой нити ДНК нуклеотидные последовательности встречаются однократно, на ее концах имеются прямые или инвертирован­ные (повернутые на 180°) повторы. Они представлены теми же нуклеотидами, которые располагаются в начальном участке ДНК- Нуклеотидные повторы, присущие как однонитевым, так и двунитевым вирусным ДНК, являются своеобразными марке­рами, позволяющими отличить вирусную ДНК от клеточной. Функциональное значение этих повторов состоит в способности замыкаться в кольцо. В этой форме она реплицируется, транс­крибируется, приобретает устойчивость к эндонуклеазам и может встраиваться в клеточный геном.

Вирусная РНК. У РНК-содержащих вирусов генетическая информация закодирована в РНК таким же кодом, как в ДНК всех других вирусов и клеточных организмов. Вирусные РНК по своему химическому составу не отличаются от РНК клеточного происхождения, но характеризуются разной структурой. Наряду с типичной для всех РНК однонитевой формой у ряда виру­сов имеется двунитевая РНК. При этом она может быть линей­ной и кольцевой. В составе однонитевых РНК имеются спираль­ные участки типа двойной спирали ДНК, образующиеся вслед­ствие спаривания комплементарных азотистых оснований. Одно­нитевые РНК в зависимости от выполняемых ими функций подразделяют на две группы. К первой относят РНК, облада­ющие способностью транслировать закодированную в ней инфор­мацию на рибосомы клетки хозяина, т. е. выполнять функцию «РНК. Ее называют плюс-нить и обозначают знаком «+» (пози­тивный геном). Ко второй группе относят вирусные одноцепочечные РНК, которые не могут функционировать как «РНК, а так же как ДНК служат лишь матрицей для ее образования. Такие РНК называют минус-нить, обозначают знаком «—» (не­гативный геном). РНК плюс-нитевых вирусов в отличие от ми-нус-нитевых имеют характерные модифицированные концы в ви­де «шапочки», которые необходимы для специфического узна­вания рибосом. Вирусные РНК состоят из нескольких фрагмен­тов (например, РНК вируса гриппа) или представлены нефраг-ментированной молекулой (РНК парамиксовирусов).

     У двунитевых как ДНК, так и РНК-содержащих вирусов информация обычно записана в одной цепи. Однако существуют вирусы, у которых информация может быть частично закоди­рована и во второй цепи. Таким образом, достигается экономия генетического материала. В то же время это указывает на то, что проведение оценки количества генетической информации по молекулярной массе ДНК или РНК может оказаться недостовер­ной.

Вирусные белки, так же как и белки клеточных организ­мов, подразделяют на структурные и функциональные. Первые входят главным образом в состав вирусного капсида, вторые представляют собой ферменты, участвующие в процессе репро­дукции вирусов.

Структурные белки у простых вирионов, лишенных суперкапсида, представлены капсидными белками, которые образуют фут­ляр, защищающий нуклеиновую кислоту. Кроме того, в их сос­тав входят белки, несущие «адресную» функцию, заключающую­ся в узнавании специфических рецепторов клеток хозяина. Они могут участвовать также в адсорбции вирусов на этих клетках и проникновении в них. У сложных вирионов, имеющих внеш­нюю оболочку, капсидные белки также выполняют защитную функцию. Однако они не принимают прямого участия в адсорб­ции вируса и проникновении в клетку хозяина. У многих сложных вирионов в составе капсидных белков содержатся ферменты, участвующие в репликации и транскрипции вирусных РНК или ДНК. Кроме того, в составе вирионов имеются так называемые «внутренние» гистоноподобные белки, связанные с вирусной нуклеиновой кислотой. Они образуют рибо- или дезоксирибо-нуклеопротеиды, которые обладают определенными антигенными свойствами.

Существенной особенностью капсидных белков является стро­го упорядоченная структура, обеспечивающая построение капсида из субъединиц-капсомеров, состоящих из идентичных полипеп­тидных цепей, способных к самосборке. Таким образом дости­гается экономия генетического материала вируса. В противном случае, для синтеза разных капсидных белков потребовалась бы информация, закодированная в гораздо большем количестве генов.

Внешняя оболочка сложных вирионов состоит из белков, которые входят в состав гликопротеидов и гликолипидов. У многих вирионов они располагаются в виде шиловидных отрост­ков на поверхности суперкапсида. Гликопротеидные шипы об­ладают антигенными свойствами. Многие из них ответствен­ны за адсорбцию на специфических рецепторах клетки и при­нимают участие в слиянии с клеточной мембраной, обеспечивая тем самым проникновение вириона в клетку хозяина. Наряду с упомянутыми соединениями в составе суперкапсида имеются гликолипиды.

Липидный и углеводный состав вириона  определяется  клеткой хозяина, но модифицируется суперкапсидными белками. Липиды стабилизируют структуру сложных вирионов.

Ферменты вирусов. В отличие от прокариот и клеток всех других организмов, вирусы лишены ферментов, участвующих в многочисленных метаболических реакциях. Однако многие вирусы содержат в составе капсидов одну или две группы фер­ментов. К первой относятся ферменты репликации и транскрип­ции, ко второй — ферменты, участвующие в проникновении ви­русной нуклеиновой кислоты в клетку хозяина и выходе обра­зовавшихся вирионов  (нейраминидаза, лизоцим,  АТФ-аза).

Ферменты вирусов подразделяют на вирионные и вирусиндуцированные. К первым относят ферменты транскрипции и репликации (ДНК- и РНК-полимеразы), обна­руженные у многих вирусов, обратная транскриптаза ретро-вирусов, а также эндо- и экзонуклеазы, АТФ-аза, нейраминида­за отдельных вирусов.

Вирусиндуцированными считаются те ферменты, структура которых закодирована в вирусном геноме. Прежде всего это от­носится к РНК-полимеразам пикорна-, тога-, орто- и парамик-совирусам, а также ДНК-полимеразе покс- и герпесвирусов.

Наряду с собственными вирусы используют клеточные фер­менты, которые не являются вирусспецифическими. Однако их активность может модифицироваться в процессе репродукции вируса.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСА С КЛЕТКОЙ ХОЗЯИНА

Взаимодействие вируса с клеткой хозяина — это сложный многоступенчатый процесс, который начинается с адсорбции вирусных частиц на рецепторах клетки хозяина и продолжа­ется после их проникновения внутрь клетки. В результате та­кого взаимодействия развивается либо продуктивная, либо абор­тивная, либо интегративная форма клеточной инфекции. При продуктивной форме происходит размножение, точнее репродукция (лат. reproduce — воспроизводить) вируса, при абортивной — ее нарушение на одном из этапов, при и н-тегративной — интеграция вирусной нуклеиновой кислоты в клеточный геном.

РЕПРОДУКЦИЯ ВИРУСОВ

Как отмечалось выше, вирусы являются самореплицирую­щейся формой, неспособной к бинарному делению, в отличие от микроорганизмов с клеточной организацией. В 50-х годах было установлено, что размножение, или репродукция, вирусов про­исходит путем репликации их нуклеиновой кислоты и биосинте­за белков с последующей самосборкой вириона. Этот процесс происходит   в   разных   частях   клетки — ядре   или   цитоплазме,          вследствие чего получил название

дизъюнктивного, т. е. разобщенного размножения.

Вирусная репродукция представляет собой уникальную форму выражения чужеродной (вирусной) информации в клетках че­ловека и животных, насекомых, растений и бактерий, которая состоит в подчинении клеточных матрично-генетических меха­низмов вирусной информации (рис. 6.).

1-я стадия — адсорбция — характеризуется прикреплением вириона к клеточным рецепторам, представляющим собой глико-протеины клеточной мембраны, содержащей нейраминовую кис­лоту. Такие рецепторы имеются у ряда клеток, в частности эритроцитов, на которых адсорбируются многие вирусы. Для орто- и парамиксовирусов специфическими рецепторами являются гликолипиды, содержащие сиаловую кислоту (ганглиозиды), для других — белки или липиды клеточной мембраны.

Рецепторами вирусов являются так называемые «прикре­пительные» белки, располагающиеся в составе капсидов прос­тых вирионов и суперкапсидов сложных вирионов. Они могут иметь форму нитей (фибры у аденовирусов) или шипов (глико-протеиновые образования на внешней оболочке орто- и парамик-со-, рабдо-, арено- и буньявирусов).

Первый этап адсорбции определяется неспецифическими си­лами межмолекулярного притяжения, второй — специфической структурной гомологией или комплементарностью рецепторов чувствительных клеток и вирусов.

2-я стадия — проникновение вируса в клетку хозяина происходит путем виропексиса и слияния мембран. Виропексис есть не что иное, как частный случай рецепторного эндоцито-за, который состоит в инвагинации участка плазматической мембраны, где имеются углубления, покрытые рецепторами снаружи, на которых адсорбируется вирус. Затем происходит образование вакуоли вокруг вируса, в составе ко­торой он находится в цитоплазме клетки хозяина. (рис.7, 8.). Описанный способ проникновения вирусных частиц характерен для аденови­русов, вируса гриппа и др.

 

Описание: Описание: Описание: D:\++Kafedra\W E B - 2014\9\09 Морфология и ультраструктура вирусов.files\image024.jpg

Рис. 6. Схема репродукции вируса

 

3-я стадия — «раздевание» вирионов — заключается в их депротеинизации и освобождении от суперкапсида и капсида, пре­пятствующих репликации вирусной нуклеиновой кислоты. «Раз­девание» вириона начинается сразу же после его прикреп­ления к клеточным рецепторам и продолжается в эндоцитарной вакуоли и ее слиянии с лизосомами при участии протеолити-ческих ферментов, а также в ядерных порах и околоядерном пространстве при слиянии с ядерной мембраной.


Описание: Описание: Описание: D:\++Kafedra\W E B - 2014\9\09 Морфология и ультраструктура вирусов.files\image026.jpg

Рис. 7. Проникновение вируса в клетку хозяина путем рецепторного эндо-цитоза (виропексис).

1 — внеклеточный онко­вирус типа С; 2 — адсорб­ция вируса на свободной клеточной поверхности; 3 — впячивание клеточной обо­лочки; 1а, 2а, За — после­довательные этапы проник­новения вируса, почкующе­гося на поверхности сосед­них клеток; 4—локализа­ция вируса в фагосоме; 5 — проникновение сердцевины вируса в цитоплазму; 6 — деструкция вируса в фаго-лизосоме. ПО — плазмати­ческая оболочка, ОВ — обо лочка вируса, От — отросток оболочки вируса; Сц — сердцевина вириона.


Описание: Описание: Описание: D:\++Kafedra\W E B - 2014\9\09 Морфология и ультраструктура вирусов.files\image028.jpg

Рис.   8.   Проникновение   вируса   в   клетку   хозяина   путем   слияния   мембран.

1 — внеклеточный онковирус; 2, 3, 4 — последовательные этапы слияния оболочки

вируса   и   клетки;   ОВ — оболочка   вириона;   От — отросток   оболочки   вируса;   Сц —сердцевина вириона.

 

4-я стадия заключается в транскрипции и репликации ви­русных геномов. Транскрипция вирусного генома двунитевых ДНК-содержащих вирусов происходит, так же как и клеточно­го генома, по триаде ДНК-> «РНК->- белок (рис. 5.5, а). Раз­личия касаются только происхождения фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразы, необходимой для данного процесса. У вирусов, геном которых транскрибируется в цитоплазме клетки хозяина (например, вирус оспы), имеется собственная вирусспецифичес-кая РНК-полимераза. Вирусы, геномы которых транскриби­руются в ядре (папова- и аденовирусы, вирусы герпеса), исполь­зуют содержащуюся там клеточную РНК-полимеразу II или III.

У РНК-содержащих вирусов транскрипция их генома осу­ществляется несколькими путями.

1. Вирусы с негативным геномом (минус-нитевые), к которым относятся орто-, парамиксо- и рабдовирусы (см. табл. 1), имеют в своем составе вирусспецифическую РНК-полиме­разу или транскриптазу. Они синтезируют ыРНК на матрице геномной РНК- Подобный фермент отсутствует в нормальных клетках,   но   синтезируется   клетками,   зараженными   вирусами.


Он   находится   в   составе  как  однонитевых,  так  и   двунитевых РНК-содержащих вирусов.

2.      У   вирусов    с    положительным    геномом    (плюс-нитевые), к которым относятся пикорна-, тогавирусы и др., функцию «РНК выполняет сам геном, который транслирует со­держащуюся в нем информацию на  рибосомы клетки хозяина.

3.      Особняком  стоит группа  РНК-содержащих ретровирусов, в составе которых имеется обратная транскриптаза, или ревертаза.  Уникальность этого фермента  состоит  в его способности переписывать информацию с РНК на ДНК- Этот процесс назывется обратной  транскрипцией.  

Как отмечалось выше, количество генов в вирусном геноме весьма ограничено. Поэтому для увеличения количества вирус­ной информации существует своеобразный трансляционный меха­низм, функционирующий через «РНК, который передает значи­тельно больше информации, чем записано в вирусной нуклеи­новой кислоте. Это достигается разными путями, например при транскрипции информации с переписывающихся участков ДНК на «РНК путем сплайсинга (вырезание бессмысленных кодонов и сшивание концов), а также йри считывании антико-донами тРНК одной и той же молекулы ыРНК с разных нуклеоти-дов. При этом образуются новые триплеты, увеличивающие ко­личество транслируемой информации.

Регуляция транскрипции осуществляется клеточными и вирус-специфическими механизмами. Она заключается в последова­тельном считывании информации с так называемых «ранних» и «поздних» генов. В первых закодирована информация для син­теза вирусспецифических ферментов транскрипции и реплика­ции, во вторых — для синтеза капсидных белков.

Вирусспецифическая информация транслируется на рибосомы клетки хозяина, которые предварительно освобождаются от кле­точных  белков  и  собираются  в  вирусспецифические  полисомы.

Репликация вирусных геномов заключается в синтезе молекул ДНК или РНК, которые накапливаются в фондах этих нуклеи­новых кислот, использующихся при сборке вирионов.

Репликация вирусной ДНК происходит на обеих нитях при участии клеточной ДНК-полимеразы. У однонитевых вирусов вначале образуется вторая нить (репликативная форма).

Репликация вирусных РНК происходит только при участии того же вирусспецифического фермента, который катализирует транскрипцию вирусного генома. У плюс-нитевых вирусов репли­кация РНК практически не отличается от их транскрипции. У минус-нитевых вирусов репликация отличается от транскрип­ции длиной образовавшихся дочерних молекул РНК- При репли­кации они полностью соответствуют по своей протяженности ма­теринской нити, а при транскрипции образуются укороченные молекулы ыРНК-

У ретровирусов репликация, так же как и транскрипция ДНК, происходит в составе клеточного генома при участии клеточной ДНК-полимеразы.

5-я стадия — сборка вириона — состоит прежде всего в образовании нуклеокапсидов. Поскольку синтез вирусных нукле­иновых кислот и белков в клетке происходит в разных структу­рах клетки, необходима транспортировка составных частей вири­она в одно место сборки. При этом вирусные белки и нуклеино­вые кислоты обладают способностью узнавать и самопроизволь­но соединяться друг с другом. В основе самосборки простых вирионов лежит способность вирусных полипептидов соединяться в капсомеры, которые, располагаясь вокруг осей симметрии, образуют многогранник. В других случаях полипептиды в виде спирали окружают вирусную нуклеиновую кислоту.

Многие простые вирионы собираются на репликативных ком­плексах — мембранах эндоплазматического ретикулума. У слож­ных вирионов сборка нуклеокапсида начинается на реплика­тивных комплексах, а затем продолжается на плазматической мембране, с наружной стороны которой располагаются суперкап­сидные гликопротеиды. Затем гликопротеидные и примыкаю­щие к ним с другой стороны нуклеокапсидные участки выпячива­ются через клеточную мембрану, образуя почку, как это имеет место у орто- и парамиксовирусов, рабдовирусов. После отде­ления почки, содержащей нуклеокапсид и суперкапсидные белки, образуются свободные вирионы. Они либо через клеточную плазматическую мембрану проходят во внеклеточное пространст­во, либо через мембрану эндоплазматического ретикулума про­никают в вакуоль эндоплазматической сети. При этом мембран­ные липиды обволакивают почку, вытесняя из нее белки. Многие ДНК-содержащие вирусы, например вирус герпеса, собираются в ядре клетки на ее мембране, где образуются нуклеокапсиды. Затем они отпочковываются в перинуклеарное пространство, приобретая внешнюю оболочку. Дальнейшее формирование вириона происходит в мембранах цитоплазматического ретику


лума   и   в   аппарате   Гольджи,   откуда   вирус  транспортируется на поверхность клетки.

6-я стадия выход вирусных частиц из клетки — происходит двумя путями. Простые вирусы, лишенные суперкапсида, напри­мер пикорнавирусы, аденовирусы и др., вызывают деструкцию клетки и попадают во внеклеточное пространство. Другие виру­сы, имеющие липопротеидную внешнюю оболочку, выходят из клетки путем почкования, в результате чего в течение длитель­ного времени она сохраняет свою жизнеспособность (рис. 9. ). Такой путь характерен для вируса гриппа и др.

Описание: Описание: Описание: D:\++Kafedra\W E B - 2014\9\09 Морфология и ультраструктура вирусов.files\image030.jpg
Рис. 9. Выход вируса иммунодефицита человека из клетки путем почкования

ИНТЕГРАЦИЯ ВИРУСНОЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ В КЛЕТОЧНЫЙ ГЕНОМ

Данный путь взаимодействия между вирусом и клеткой хо­зяина не одинаков для ДНК- и РНК-содержащих вирусов. В первом случае вирусная ДНК в кольцевой форме интегрирует в клеточный геном. При этом место интеграции определяется гомологичными нуклеотидными последовательностями, имеющи­мися в определенных участках — ДНК сайтах при участии ряда ферментов: рестриктаз, эндонуклеаз, лигаз. Вирус, интег­рированный в клеточный геном, называют провирусом.

В случае РНК-содержащих вирусов включение РНК в кле­точный геном происходит путем обратной транскрипции. Механизм обратной транскрипции состоит в перво­начальном образовании ДНК-транскрипта на матрице РНК при обязательном участии обратной транскриптазы. Этот транс­крипт представляет собой одну нить ДНК, являющуюся матри­цей для образования второй нити. Затем образовавшийся дву-нитевой ДНК-транскрипт замыкается в кольцо и встраивается в клеточный геном. Данный процесс объединения вирусной нук­леиновой кислоты с хромосомой клетки хозяина называется в и р о г е н и е й. В интегрированном состоянии вирусная ДНК мо­жет транскрибироваться в составе клеточного генома при участии клеточных РНК-полимераз.

Биологический смысл интегративного типа взаимодействия между вирусом и клеткой хозяина можно видеть прежде всего в сохранении вирусной информации в составе клеточного гено­ма и ее передаче потомству. Вместе с тем это в определенной степени отражается и на эволюции некоторых вирусов (на­пример, бактериофагов), которые при выщеплении из состава клеточной хромосомы могут захватывать отдельные ее гены.

С другой стороны, подобный тип взаимодействия может отразиться на судьбе клеток хозяина в зависимости от располо­жения локуса, в котором происходит интеграция вирусного генома, вплоть до расстройства регуляции синтеза белка и неконтролируемого деления клетки. Это может при­вести к онкогенной трансформации клеток хозяина и развитию разнообразных опухолей.

 

 

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ

На первом этапе развития вирусологии единственным мето­дом, доказывающим наличие фильтрующихся инфекционных агентов в исследуемом материале, служило заражение лабора­торных животных. В 1931 г. в вирусологической практике стали использоваться куриные эмбрионы для репродукции вирусов с диагностическими целями, а также для производства вирусных вакцин.

   Методы культивирования вирусов. Вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами, потому они могут репродуцироваться только в живой клетке. Исходя из этого, предложены три основных способа культивирования вирусов: на лабораторных животных, куриных эмбрионах и культурах клеток.
     Лабораторных животных используют для выделения вирусов и их идентификации из клинического, секционного материала в биологических пробах и реакциях нейтрализации. Для этого служат многообразные виды животных: белые мыши (взрослые и сосунки), гвинейские свинки, хомяки, кролики, мартышки, которых можно заражать в мозг, внутрибрюшинно, интраназально, под кожу и тому подобное. В зависимости от вида возбудителя, у подопытных животных развиваются характерные признаки поражения (рис.10.)
  

Описание: Описание: Описание: D:\++Kafedra\W E B - 2014\9\09 Морфология и ультраструктура вирусов.files\image032.jpg

Рис. 10. Заражение мышей-сосунков при коксаки инфекции

 

  Куриные эмбрионы используют для выделения вирусов и определения их вида. Доступность и относительная дешевизна эмбрионов, простота в работе позволяют использовать их для приготовления диагностических препаратов и получения вакцин. Как правило, работают с 5-12-14-дневными эмбрионами. Заражения проводят открытым и закрытым способом в полость алантоису, полость амниона, на хорионалантоисну оболочку, в желтковый мешок (рис.11.).

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Scheme_1

 

Описание: Описание: Описание: D:\++Kafedra\W E B - 2014\9\09 Морфология и ультраструктура вирусов.files\image036.png

Рис. 11. Заражение куриных эмбрионов. Бляшки на хорионалантоисной оболочке.

 

Современную вирусологическую диагностику трудно представить без использования клеточных культур. Культуры клетки разделяют на ряд групп. Первичные культуры получают из тканей человека или животных при их ферментативной дезинтеграции с помощью трипсина, хемотрипсина или версена. Культуры могут выдерживать до 10 делений в условиях in vitro. Они чувствительные ко многим вирусам, их можно получать в лабораториях в любом количестве. Чаще всего используют культуры почек эмбриона человека, почек мартышек, свиней, фибробласты куриных эмбрионов.


   Перевиваемые
культуры — клетки, которые приобрели способность к безграничному росту. Как правило, они являются производными опухолей человека или животных. Такие культуры чувствительные ко многим вирусам, имеют тенденцию к безграничному росту, потому приобрели широкое применение в вирусологических лабораториях. Их выращивают в виде однослойных культур на поверхности стекла в флаконах или суспензии. Используют тканевые культуры HeLa (карцинома шейки матки), Hер 2 (карцинома гортани человека), КВ (карцинома ротовой полости).

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: CPE!
   Рис. 12. Нормальный монослой клеток (а), цитопатический эффект (
b, c).

 

Диплоидные культуры — особенная группа клеток одного типа, которые выдерживают в лабораторных условиях до 100 пассажей, храня при этом исходный диплоидный набор хромосом. Они свободные от контаминации вирусами, микоплазмами, грибами, онкогенно безопасные, высокостабильные. Культуры линий IMR-90 (из легких 16-недельного плода человека) и J (клетки крови) используют для получения вакцинных штаммов вирусов.
   При размножении вирусов в тканевых культурах происходят многообразные изменения клеток. Всю совокупность их называют цитопатическим действием (ЦПД) или цитопатическим эффектом. Одни вирусы вызывают полную деструкцию (разрушение) клеток и отпадения их монослоя от стенки пробирки или флакона. Так действует, например, вирус полиомиелита. Другие вирусы вызывают в клетках разной степени дегенеративные изменения ядра и цитоплазмы, появление специфических включений и тому подобное. Такое цитопатическое действие проявляют вирусы натуральной оспы, бешенства, аденовирусы, герпесвируси. При заражении культуры вирусом кори или респираторно-синцитиальним вирусом образуются гигантские многоядерные отростчатые клетки — так называемые синцитии и симпласты (рис. 13, 14, 15, 16). Онкогенные вирусы вызывают ЦПД в виде клеточной пролиферации, что предопределяет образование опухолей.

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: CPE3

Рис. 13. Различные виды цитопатического эффекта в культуре клеток

 

 

Описание: Описание: Описание: D:\++Kafedra\W E B - 2014\9\09 Морфология и ультраструктура вирусов.files\image042.jpg

Рис. 14. Нормальный монослой (слева)и деструкция монослоя (справа)

Описание: Описание: Описание: D:\++Kafedra\W E B - 2014\9\09 Морфология и ультраструктура вирусов.files\image044.png

Рис. 15. Цитопатический эффект в почечных клетках обезьяны 

Описание: Описание: Описание: D:\++Kafedra\W E B - 2014\9\09 Морфология и ультраструктура вирусов.files\image046.png

Рис.16. Формирование синцития (многоядерных клеток).

 

ВИРУСЫ БАКТЕРИЙ (БАКТЕРИОФАГИ, ИЛИ ФАГИ)

В 1917 г. французский микробиолог Д’Эррель изучал возбу­дителя дизентерии, наблюдал лизис бактериальной культуры при внесении в нее фильтрата испражнений больных людей.

Лизирующее начало сохранялось при многократном пассиро­вании культуры дизентерийных бактерий и даже становилось более активным. Агент, растворяющий бактерии, автор называл бактериофагом («пожиратель» бактерий от лат. phagos — пожирающий), а действие бактериофага, заканчивающе­еся лизисом бактерий, — феноменом бактериофагии.

Вместе с тем Д’Эррель правильно оценил биологический смысл открытого им феномена. Он высказал предположение, что бактериофаг является инфекционным агентом, лизирующим бактерии, вследствие чего в окружающую среду поступают дочерние фаговые частицы. На твердых средах, засеянных смесью фага с бактериальной культурой, в местах лизиса бак­терий появляются стерильные пятна или негативные колонии фагов. Посев этой же бактериальной культуры на жидкую среду приводит к просветлению среды. Позднее было показано, что фа­ги являются бактериальными вирусами, имеющими в качестве хозяев бактерии определенных видов. Номенклатура бактериофа­гов основана на видовом наименовании хозяина. Например, фа­ги, лизирующие дизентерийные бактерии, получили название ди­зентерийных бактериофагов, сальмонеллы — сальмонеллезных бактериофагов, дифтерийные бактерии — дифтерийных бактери­офагов и т. д.

В истории микробиологии изучение феномена бактериофагии занимает особое место. Простота культивирования, короткий пе­риод генерации, высокий выход фагового потомства и возмож­ность точного его количественного учета способствовали ус­пешному изучению многих проблем молекулярной генетики и общей вирусологии. В частности, в системе фаг — бактериаль­ная клетка впервые было открыто явление лизогении, по­лучившее позднее название интегративной инфекции.

Структура. Большинство фагов имеют сперматозоидную форму. Они состоят из головки, которая содержит нуклеиновую кислоту, и отростка. У некоторых фагов отросток очень корот­кий или вовсе отсутствует. Размеры фаговой частицы колеблются от 20 до 200 нм. Средний диаметр головки равен 60—100 нм, длина отростка 100—200 нм.

Различают несколько морфологических типов бактериофагов. К I типу относятся нитевидные ДНК-содержащие фаги, которые лизируют клетки бактерий, несущих F-плазмиду. II тип составляют фаги с аналогом отростка. Это мел­кие РНК-содержащие фаги и однонитевой ДНК — фаг ф%174. К III типу относятся фаги ТЗ, Т7 с коротким отростком, к IV типу — фаги с несокращающимся чехлом отростка и двуните-вой ДНК (Tl, T5 и др.). V тип представляют ДНК-содержащие фаги с сокращающимся чехлом отростка, заканчивающимся базальной пластинкой разной формы  (Т2, Т4, Т6).

Наиболее изучены Т-фаги (англ. type — типовые). Они со­ставляют Т-группу коли-дизентерийных фагов, включающую 7 представителей: 4 нечетных Т1, ТЗ, Т5 и Т7 и 3 четных Т2, Т4, Т6. Наиболее сложной оказалась структура Т-четных фагов, в частности Т2 (см. рис. 17). Он состоит из головки гексагона­льной формы и отростка. Последний образован полым стержнем диаметром около 8 нм. Снаружи стержень окружен чехлом, спо­собным к сокращению. На дистальном конце отростка имеется шестиугольная базальная пластинка, в углах которой распола­гаются короткие зубцы. От каждого зубца отходит по одной нити длиной 150 нм. Базальная пластинка и нити осуществляют процесс адсорбции фага на бактериальной клетке.

 

Описание: image004

 

Рис. 17, 18. Основные структуры бактериофага.

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Phage Binding to Cell

 

 

Химический состав. Фаги, как и другие вирусы, состоят из нуклеиновой кислоты и белка. Большинство их них содержат двунитевую ДНК, которая замкнута в кольцо. Однако сущест­вуют и однонитевые фаги, например фаг фх174. В составе некоторых фагов обнаружены ДНК с необычными азотистыми основаниями. Так, у фага Т2 вместо цитозина содержится 5-ок-симетилцитозин. Некоторые фаги содержит РНК.

Капсид головки фага и чехол отростка построены из поли­пептидных субъединиц по кубическому (головка) и спираль­ному (отросток) типу симметрии.

В частицах некоторых фагов под чехлом дистальной части        отростка (фаг Т2)

содержится фермент лизоцим. Внутри голов­ки у фага Т2 обнаружен внутренний белок, в состав которого входят полиамины (спермин, путресцин). Этот белок играет оп­ределенную роль в суперспирализации фаговой ДНК, которая только в таком виде может разместиться в сравнительно не­большой головке.

Резистентность к факторам окружающей среды. Фаги более устойчивы к действию физических и химических факторов, чем многие вирусы человека. Большинство из них инактивируются при температуре свыше 65°—70 °С. Они хорошо переносят за­мораживание и длительно сохраняются при низких температу­рах и высушивании. Сулема (0,5% раствор), фенол (1 % раст­вор) не оказывают на них инактивирующего действия. В то же время 1 % раствор формалина инактивирует фаг через несколь­ко минут. Ультрафиолетовые лучи и ионизирующая радиация так­же вызывают инактивирующий эффект, а в низких дозах — му­тации.

Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой характери­зуется последовательной сменой тех же стадий, которые были рассмотрены для вирусов животных и человека. Однако имеют­ся и некоторые особенности.

Адсорбция фага на бактериальной клетке происходит только при соответствии фаговых рецепторов, расположенных на конце отростка, с рецепторами бактериальной клетки, связан­ными с клеточной стенкой. Некоторые фаги адсорбируются на половых ворсинках (sex pili), контролируемых F— или R-плаз-мидами. На бактериях, полностью лишенных клеточ­ных стенок (протопласты), адсорбции фагов не происходит.

На адсорбцию фагов большое влияние оказывают состав и рН среды, температура, а также наличие некоторых аминокис­лот или других соединений, например триптофана для фага Т2.

Проникновение фага в бактериальную клетку про­исходит путем инъекции нуклеиновой кислоты через канал отрос­тка. При этом, в отличие от вирусов человека и животных, капсидные белки головки и отростка остаются вне клетки. (рис. 19.)

Некоторые фаги вводят свою ДНК без предварительного повреждения клеточной стенки бактерий, другие — сквозь от­верстия, которые они пробуравливают в клеточной стенке с помощью лизоцима, содержащегося в их капсиде.

Однонитевая ДНК фага срх174, а также нуклеиновая кис­лота нитчатых фагов проходят в клетку вместе с одним из кап-сидных белков.

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: PHAGES2

 

Описание: image009

 

 

Рис. 19. Адсорбция и проникновение фага в клетку

 

Репликация фаговой нуклеиновой кислоты и синтез фагоспецифических ферментов транскрипции и реплика­ции происходят примерно так же, как и при репродукции дру­гих вирусов. Однако латентный период инфекции, т. е. время для формирования фагового потомства, значительно короче.

Сборка фаговых частиц, или морфогенез, заключается в заполнении фаговой ДНК пустотелых капсид головки (рис. 20.)

 

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Synthesis of Phage Components

 

Рис. 20. Репликация нуклеиновой кислоты и сборка фаговых частиц.

Выход зрелых фагов из бактериальной клетки про­исходит путем «взрыва», во время которого зараженные бакте­рии лизируются. Лизис происходит при участии фагового лизоцима либо без него.(рис. 21.) Некоторые ДНК-содержащие нитчатые фаги (например, фаг fd) освобождаются из клетки путем «про­сачивания» ДНК через цитоплазматическую мембрану и кле­точную стенку бактерии, во время которого они приобрета­ют капсиды. Бактериальная клетка при этом сохраняет свою жизнеспособность.

 

Описание: image058

Рис. 21. Выход зрелых фагов из клетки.

 

 

Лизогения. Наряду с описанным продуктивным типом вза­имодействия бактериального вируса с клеткой хозяина, закан­чивающегося образованием фагового потомства и лизисом бак­терий, это взаимодействие может происходить по интегративному типу. Фаги, вызывающие данный тип инфекции, получили на­звание умеренных. Они отличаются от вирулентных тем, что встраивают свою ДНК в бактериальный геном, с кото­рым реплицируются. Фаговая ДНК, ассоциированная с геномом своего хозяина, носит название профага. Бактериальные клетки, содержащие профаг, называются л и-зогенными, а само явление — лизогенией. Это назва­ние отражает потенциальную способность лизогенных бактерий к лизису при освобождении профага из состава бактериаль­ного генома и перехода в вирулентный фаг, способный репро­дуцироваться.

Спонтанный лизис нередко происходит в отдельных клетках популяции лизогенных бактерий, но не захватывает все клетки. Это связано со способностью лизогенных бактерий приобретать иммунитет к последующему заражению одноименным фагом, вследствие чего остальные лизогенные клетки, содержащиеся в бактериальной популяции, полностью сохраняют свою целост­ность и жизнеспособность.

Продукция фагов лизогенными бактериями значительно уве­личивается при их облучении суббактерицидными дозами УФ-лучей или обработке некоторыми химическими соединениями, взаимодействующими с их ДНК. Данный феномен называется индукцией   профага.

Как уже отмечалось, наличие профага в составе бактериаль­ного генома не мешает репликации ДНК бактериальной клет­ки и самого профага. Однако гены профага самостоятельно не транскрибируются, что связано с образованием репрессора — низкомолекулярного белка, блокирующего данный процесс. Син­тез репрессора контролируется генами профага. При инактива­ции репрессора УФ-облучением профаг выходит из состава бак­териального генома и превращается в вирулентный фаг, вызы­вающий продуктивную инфекцию.

Лизогенизация лежит в основе фаговой или лизогеннрй конверсии. Она заключается в изменении свойств у лизоген­ных бактерий, например приобретении способности продуци­ровать  токсин,   изменять  морфологию,   антигенные  свойства  и другие признаки. Механизм этого явления связан с внесением новой информации в бактериальную клетку.

Умеренные фаги могут быть дефектными, т. е. неспособ­ными образовывать фаговое потомство, например, трансдуци-рующие фаги. Их используют в качестве векторов в генной инженерии.

Практическое применение бактериофагов. Строгая специфич­ность бактериофагов позволяет использовать их для фаготипи­рования и дифференцировки бактериальных культур, а также для индикации их во внешней среде, например в водоемах.

Метод фаготипирования бактерий широко применяется в ми­кробиологической практике. Он позволяет не только определить

видовую принадлежность исследуемой культуры, но и ее ф а г о тип (фаговар). Это связано с тем, что у бактерий одного и того же вида имеются рецепторы, адсорбирующие строго опре­деленные фаги, которые затем вызывают их лизис. Использова­ние наборов таких типоспецифических фагов позволяет проводить фаготипирование исследуемых культур с целью эпидемиологи­ческого анализа инфекционных заболеваний: установления источника инфекции и путей ее передачи.

Кроме того, по наличию фагов во внешней среде (водоемах) можно судить о содержании в них соответствующих бактерий, представляющих опасность для здоровья человека. Данный метод индикации патогенных бактерий также применяется в эпи­демиологической практике. Его эффективность повышается при постановке реакции нарастания титра фага, которая основана на способности специфических линий фагов репродуцироваться на строго определенных бактериальных культурах. При внесении такого фага в исследуемый материал, содержащий искомый воз­будитель, происходит нарастание его титра (рис. 22.). Широкое исполь­зование реакции нарастания титра фага осложняется труд­ностью получения индикаторных наборов фагов и другими при­чинами.

 

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Lysogeny

Рис. 22. Титрование фага, образование стерильных пятень

 

Применение фагов с лечебными и профилактическими целя­ми проводится сравнительно редко. Это связано с большим ко­личеством отрицательных результатов, которые объясняются следующими причинами: 1) строгой специфичностью фагов, ли-зирующих только те клетки бактериальной популяции, которые снабжены соответствующими рецепторами, вследствие чего фаго-резистентные особи, имеющиеся в каждой популяции, полностью сохраняют свою жизнеспособность; 2) широким применением более эффективных этиотропных средств — антибиотиков, не об­ладающих специфичностью бактериофагов.

В нашей стране выпускаются препараты дизентерийного, сальмонеллезных, коли-прртейного, стафилококкового и других бактериофагов, а также наборы для фаготипирования брюшно­тифозных бактерий, стафилококков и др. Последние широко применяются с эпидемиологическими целями для установления ис­точника инфекции. Так, например, в случае выделения от раз­ных больных бактериальных культур, принадлежащих не только к одному виду, но и к одному фаготипу, можно считать, что они заразились из одного и того же источника инфекции. В случае выделения разных фаготипов следует искать несколько источ­ников инфекции.

В настоящее время препараты бактериофагов применяются для лечения дизентерии, сальмонеллеза, гнойной инфекции, вы­званных антибиотикорезистентными бактериями. При этом в каждом случае предварительно определяют чувствительность вы­деленных возбудителей к данному препарату бактериофага.

Сальмонеллезные фаги применяются для профилактики одноименного заболевания в детских коллективах.

 

Серологические реакции в вирусологии.

Гемагглютинация — это феномен склеивания эритроцитов под воздействием вирусов. Некоторые вирусы имеют на своей оболочке рецепторы, комплементарні рецепторам поверхности эритроцитов определенных животных, и при добавлении к суспензии вирусов эритроцитов, последние склеиваются. Однако эта реакция не иммунологическая, потому что в ней не принимает участия основная система – антиген и антитело.(рис. 23, 24.)

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: R

 

Рис. 23. Схема реакции гемагглютинации

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: R

Рис. 24. Реакция гемагглютинации

Описание: Описание: Описание: D:\++Kafedra\W E B - 2014\9\09 Морфология и ультраструктура вирусов.files\image068.png

Рис. 25. Реакция гемадсорбции

Реакция торможения гемагглютинации (РГГА) принадлежит к серологическим реакциям иммунитета. В РГГА специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), лишают его свойства склеивать эритроциты. (рис. 26.)

 

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: hemagglutination

Рис. 26. Реакция торможения гемагглютинации

 

Реакция нейтрализации вирусов.   В основе реакции лежит  способность специфических антител крепко связываться с вирусом,  в итоге вирус не может адсорбироваться на чувствительных клетках и размножаться у них.

Для постановки реакции необходимое наличие вируса, сыворотки, которая содержит антитела, и биологического объекта, который выступает индикатором нейтрализации. Такими объектами могут быть в зависимости от вида вируса лабораторные животные, куриные эмбрионы, тканевые культуры.

 

 Иммуноферментный метод (ИФА). В иммуноферметных методах антиген взаимодействует с антителом, при этом один из реагентов связан с энзимом. Для выявления этой ензимной метки необходимый соответствующий субстрат (хромоген), который реагирует в месте соединения антигена с антителом с мобилизованным ферментом, изменяя окраску реагирующей смеси.(рис. 26, 27.).

Для такой метки широко используется фермент – пероксидаза хрена, которая в зависимости от субстрату дает разноцветные продукты реакции.

Различают прямые и непрямые иммуноферментные методы.

Прямой метод. На первом этапе реакции антиген реагирует с антителом, меченым пероксидазой, потом к образованному комплексу добавляют соответствующий субстрат (например, Н2О2 и 5-аминосалицилову кислоту). 

Непрямой метод. Сначала антиген  реагирует с антителами, образовывая комплекс антиген – антитело, после промывания в систему вносят противоглобулиновые антитела, меченые пероксидазой, которые связываются с первым комплексом. После следующего промывания  вносят субстрат, который, разлагаясь адсорбируемым энзимом, предопределяет появление соответствующей окраски.

 

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: R

Рис. 26. Иммуноферментный метод (ИФА).

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: R

Рис. 27. Иммуноферментный метод (ИФА).

 

Иммуноблотинг. Для проведения иммуноблотинга исследуемые антигены сначала разделяют с помощью элетрофореза в геле. Полученные фракции электрофоретически переносят на листок нитроцеллюлозы (блот), который находится в специальной камере. Фиксированные блоты обрабатывают специфическими к антигену антителами, отмывают и добавляют радиоактивно меченный коньюгат для выявления антител, которые связались с антигеном.(рис. 28, 29)

После повторного промывания листок нитроцеллюлозы размещают в кассете с рентгеновской пленкой для радиоаутографии. На проявленной пленке появятся полосы локализации антигена, который связал меченые антитела.

Вместо радиоактивной метки можно использовать люминесцентные антитела или антитела, коньюгированные с ферментом. В последнем случае субстрат для энзима (хромоген) должен быть предварительно нанесенный на нитроцеллюлозную мембрану.

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: R

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: R

Рис. 28, 29. Иммуноблотинг (схема и результат постановки)

 

 

ВИРУСЫ БАКТЕРИЙ (БАКТЕРИОФАГИ, ИЛИ ФАГИ)

В 1917 г. французский микробиолог Д’Эррель изучал возбу­дителя дизентерии, наблюдал лизис бактериальной культуры при внесении в нее фильтрата испражнений больных людей.

Лизирующее начало сохранялось при многократном пассиро­вании культуры дизентерийных бактерий и даже становилось более активным. Агент, растворяющий бактерии, автор называл бактериофагом («пожиратель» бактерий от лат. phagos — пожирающий), а действие бактериофага, заканчивающе­еся лизисом бактерий, — феноменом бактериофагии.

Вместе с тем Д’Эррель правильно оценил биологический смысл открытого им феномена. Он высказал предположение, что бактериофаг является инфекционным агентом, лизирующим бактерии, вследствие чего в окружающую среду поступают дочерние фаговые частицы. На твердых средах, засеянных смесью фага с бактериальной культурой, в местах лизиса бак­терий появляются стерильные пятна или негативные колонии фагов. Посев этой же бактериальной культуры на жидкую среду приводит к просветлению среды. Позднее было показано, что фа­ги являются бактериальными вирусами, имеющими в качестве хозяев бактерии определенных видов. Номенклатура бактериофа­гов основана на видовом наименовании хозяина. Например, фаги, лизирующие дизентерийные бактерии, получили название ди­зентерийных бактериофагов, сальмонеллы — сальмонеллезных бактериофагов, дифтерийные бактерии — дифтерийных бактери­офагов и т. д.

В истории микробиологии изучение феномена бактериофагии занимает особое место. Простота культивирования, короткий пе­риод генерации, высокий выход фагового потомства и возможность точного его количественного учета способствовали ус­пешному изучению многих проблем молекулярной генетики и общей вирусологии. В частности, в системе фаг — бактериальная клетка впервые было открыто явление лизогении, получившее позднее название интегративной инфекции.

Структура. Большинство фагов имеют сперматозоидную форму. Они состоят из головки, которая содержит нуклеиновую кислоту, и отростка. У некоторых фагов отросток очень корот­кий или вовсе отсутствует. Размеры фаговой частицы колеблются от 20 до 200 нм. Средний диаметр головки равен 60—100 нм, длина отростка 100—200 нм.

Различают несколько морфологических типов бактериофагов. К I типу относятся нитевидные ДНК-содержащие фаги, которые лизируют клетки бактерий, несущих F-плазмиду. II тип составляют фаги с аналогом отростка. Это мел­кие РНК-содержащие фаги и однонитевой ДНК — фаг ф%174. К III типу относятся фаги ТЗ, Т7 с коротким отростком, к IV типу — фаги с несокращающимся чехлом отростка и двуните-вой ДНК (Tl, T5 и др.). V тип представляют ДНК-содержащие фаги с сокращающимся чехлом отростка, заканчивающимся базальной пластинкой разной формы  (Т2, Т4, Т6).

Наиболее изучены Т-фаги (англ. type — типовые). Они со­ставляют Т-группу коли-дизентерийных фагов, включающую 7 представителей: 4 нечетных Т1, ТЗ, Т5 и Т7 и 3 четных Т2, Т4, Т6. Наиболее сложной оказалась структура Т-четных фагов, в частности Т2 (см. рис. 17). Он состоит из головки гексагона­льной формы и отростка. Последний образован полым стержнем диаметром около 8 нм. Снаружи стержень окружен чехлом, спо­собным к сокращению. На дистальном конце отростка имеется шестиугольная базальная пластинка, в углах которой распола­гаются короткие зубцы. От каждого зубца отходит по одной нити длиной 150 нм. Базальная пластинка и нити осуществляют процесс адсорбции фага на бактериальной клетке.

 Химический состав. Фаги, как и другие вирусы, состоят из нуклеиновой кислоты и белка. Большинство их них содержат двунитевую ДНК, которая замкнута в кольцо. Однако сущест­вуют и однонитевые фаги, например фаг фх174. В составе некоторых фагов обнаружены ДНК с необычными азотистыми основаниями. Так, у фага Т2 вместо цитозина содержится 5-ок-симетилцитозин. Некоторые фаги содержит РНК.

Капсид головки фага и чехол отростка построены из поли­пептидных субъединиц по кубическому (головка) и спиральному (отросток) типу симметрии.

В частицах некоторых фагов под чехлом дистальной части отростка (фаг Т2)

содержится фермент лизоцим. Внутри головки у фага Т2 обнаружен внутренний белок, в состав которого входят полиамины (спермин, путресцин). Этот белок играет оп­ределенную роль в суперспирализации фаговой ДНК, которая только в таком виде может разместиться в сравнительно не­большой головке.

Резистентность к факторам окружающей среды. Фаги более устойчивы к действию физических и химических факторов, чем многие вирусы человека. Большинство из них инактивируются при температуре свыше 65°—70 °С. Они хорошо переносят за­мораживание и длительно сохраняются при низких температурах и высушивании. Сулема (0,5% раствор), фенол (1 % раствор) не оказывают на них инактивирующего действия. В то же время 1 % раствор формалина инактивирует фаг через несколь­ко минут. Ультрафиолетовые лучи и ионизирующая радиация таке вызывают инактивирующий эффект, а в низких дозах — мутации.

Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой характери­зуется последовательной сменой тех же стадий, которые были рассмотрены для вирусов животных и человека. Однако имеют­ся и некоторые особенности.

Адсорбция фага на бактериальной клетке происходит только при соответствии фаговых рецепторов, расположенных на конце отростка, с рецепторами бактериальной клетки, связаными с клеточной стенкой. Некоторые фаги адсорбируются на половых ворсинках (sex pili), контролируемых F— или R-плаз-мидами. На бактериях, полностью лишенных клеточ­ных стенок (протопласты), адсорбции фагов не происходит.

На адсорбцию фагов большое влияние оказывают состав и рН среды, температура, а также наличие некоторых аминокислот или других соединений, например триптофана для фага Т2.

Проникновение фага в бактериальную клетку про­исходит путем инъекции нуклеиновой кислоты через канал отрос­тка. При этом, в отличие от вирусов человека и животных, капсидные белки головки и отростка остаются вне клетки. (рис. 19.)

Некоторые фаги вводят свою ДНК без предварительного повреждения клеточной стенки бактерий, другие — сквозь от­верстия, которые они пробуравливают в клеточной стенке с помощью лизоцима, содержащегося в их капсиде.

Однонитевая ДНК фага срх174, а также нуклеиновая кис­лота нитчатых фагов проходят в клетку вместе с одним из кап-сидных белков.

 Репликация фаговой нуклеиновой кислоты и синтез фагоспецифических ферментов транскрипции и репликации происходят примерно так же, как и при репродукции других вирусов. Однако латентный период инфекции, т. е. время для формирования фагового потомства, значительно короче.

Сборка фаговых частиц, или морфогенез, заключается в заполнении фаговой ДНК пустотелых капсид головки.

Выход зрелых фагов из бактериальной клетки происходит путем «взрыва», во время которого зараженные бактерии лизируются. Лизис происходит при участии фагового лизоцима либо без него.(рис. 21.) Некоторые ДНК-содержащие нитчатые фаги (например, фаг fd) освобождаются из клетки путем «про­сачивания» ДНК через цитоплазматическую мембрану и клеточную стенку бактерии, во время которого они приобретают капсиды. Бактериальная клетка при этом сохраняет свою жизнеспособность.

Лизогения. Наряду с описанным продуктивным типом вза­имодействия бактериального вируса с клеткой хозяина, закан­чивающегося образованием фагового потомства и лизисом бактерий, это взаимодействие может происходить по интегративному типу. Фаги, вызывающие данный тип инфекции, получили на­звание умеренных. Они отличаются от вирулентных тем, что встраивают свою ДНК в бактериальный геном, с кото­рым реплицируются. Фаговая ДНК, ассоциированная с геномом своего хозяина, носит название профага. Бактериальные клетки, содержащие профаг, называются л и-зогенными, а само явление — лизогенией. Это назва­ние отражает потенциальную способность лизогенных бактерий к лизису при освобождении профага из состава бактериаль­ного генома и перехода в вирулентный фаг, способный репро­дуцироваться.

Спонтанный лизис нередко происходит в отдельных клетках популяции лизогенных бактерий, но не захватывает все клетки. Это связано со способностью лизогенных бактерий приобретать иммунитет к последующему заражению одноименным фагом, вследствие чего остальные лизогенные клетки, содержащиеся в бактериальной популяции, полностью сохраняют свою целост­ность и жизнеспособность.

Продукция фагов лизогенными бактериями значительно уве­личивается при их облучении суббактерицидными дозами УФ-лучей или обработке некоторыми химическими соединениями, взаимодействующими с их ДНК. Данный феномен называется индукцией   профага.

Как уже отмечалось, наличие профага в составе бактериального генома не мешает репликации ДНК бактериальной клетки и самого профага. Однако гены профага самостоятельно не транскрибируются, что связано с образованием репрессора — низкомолекулярного белка, блокирующего данный процесс. Син­тез репрессора контролируется генами профага. При инактивации репрессора УФ-облучением профаг выходит из состава бак­териального генома и превращается в вирулентный фаг, вызы­вающий продуктивную инфекцию.

Лизогенизация лежит в основе фаговой или лизогеннрй конверсии. Она заключается в изменении свойств у лизогенных бактерий, например приобретении способности продуцировать  токсин,   изменять  морфологию,   антигенные  свойства  и другие признаки. Механизм этого явления связан с внесением новой информации в бактериальную клетку.

Умеренные фаги могут быть дефектными, т. е. неспособ­ными образовывать фаговое потомство, например, трансдуци-рующие фаги. Их используют в качестве векторов в генной инженерии.

Практическое применение бактериофагов. Строгая специфич­ность бактериофагов позволяет использовать их для фаготипи­рования и дифференцировки бактериальных культур, а также для индикации их во внешней среде, например в водоемах.

Метод фаготипирования бактерий широко применяется в ми­кробиологической практике. Он позволяет не только определить

видовую принадлежность исследуемой культуры, но и ее ф а г о тип (фаговар). Это связано с тем, что у бактерий одного и того же вида имеются рецепторы, адсорбирующие строго опре­деленные фаги, которые затем вызывают их лизис. Использова­ние наборов таких типоспецифических фагов позволяет проводить фаготипирование исследуемых культур с целью эпидемиологи­ческого анализа инфекционных заболеваний: установления источника инфекции и путей ее передачи.

Кроме того, по наличию фагов во внешней среде (водоемах) можно судить о содержании в них соответствующих бактерий, представляющих опасность для здоровья человека. Данный метод индикации патогенных бактерий также применяется в эпи­демиологической практике. Его эффективность повышается при постановке реакции нарастания титра фага, которая основана на способности специфических линий фагов репродуцироваться на строго определенных бактериальных культурах. При внесении такого фага в исследуемый материал, содержащий искомый возбудитель, происходит нарастание его титра (рис. 22.). Широкое исполь­зование реакции нарастания титра фага осложняется труд­ностью получения индикаторных наборов фагов и другими причинами.

Применение фагов с лечебными и профилактическими целя­ми проводится сравнительно редко. Это связано с большим ко­личеством отрицательных результатов, которые объясняются следующими причинами: 1) строгой специфичностью фагов, ли-зирующих только те клетки бактериальной популяции, которые снабжены соответствующими рецепторами, вследствие чего фаго-резистентные особи, имеющиеся в каждой популяции, полностью сохраняют свою жизнеспособность; 2) широким применением более эффективных этиотропных средств — антибиотиков, не об­ладающих специфичностью бактериофагов.

В нашей стране выпускаются препараты дизентерийного, сальмонеллезных, коли-прртейного, стафилококкового и других бактериофагов, а также наборы для фаготипирования брюшно­тифозных бактерий, стафилококков и др. Последние широко при­меняются с эпидемиологическими целями для установления ис­точника инфекции. Так, например, в случае выделения от раз­ных больных бактериальных культур, принадлежащих не только к одному виду, но и к одному фаготипу, можно считать, что они заразились из одного и того же источника инфекции. В случае выделения разных фаготипов следует искать несколько источ­ников инфекции.

В настоящее время препараты бактериофагов применяются для лечения дизентерии, сальмонеллеза, гнойной инфекции, вы­званных антибиотикорезистентными бактериями. При этом в каждом случае предварительно определяют чувствительность вы­деленных возбудителей к данному препарату бактериофага.

Сальмонеллезные фаги применяются для профилактики од­ноименного заболевания в детских коллективах.

 

Серологические реакции в вирусологии.

Гемагглютинация — это феномен склеивания эритроцитов под воздействием вирусов. Некоторые вирусы имеют на своей оболочке рецепторы, комплементарні рецепторам поверхности эритроцитов определенных животных, и при добавлении к суспензии вирусов эритроцитов, последние склеиваются. Однако эта реакция не иммунологическая, потому что в ней не принимает участия основная система – антиген и антитело.

В основе реакции гемагглютинации лежит феномен склеивания эритроцитов, происходящий под влиянием различных факторов. Различают прямую и непрямую гемагглютинацию.
При реакции прямой гемагглютинации происходит склеивание эритроцитов при адсорбции на них определенных антигенов, например вирусов.


В серологических исследованиях применяют реакцию торможения прямой гемагглютинации, когда выделенный у больного вирус нейтрализуют специфической иммунной сывороткой, а затем соединяют с эритроцитами. Отсутствие гемагглютинации говорит о соответствии вируса и используемой иммунной сыворотки.


Реакция непрямой гемагглютинации (пассивная гемагглютинация) наблюдается в тех случаях, когда к эритроцитам, заранее обработанным (сенсибилизированным) различными антигенами, прибавляют иммунную сыворотку или сыворотку больного, имеющую соответствующие антитела. Происходит специфическое Склеивание эритроцитов, их пассивная гемагглютинация.


Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации по чувствительности и специфичности превосходит другие серологические методы, и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими.


Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации состоит из нескольких этапов. Вначале эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, затем при необходимости (при использовании антигенов белковой природы) их обрабатывают раствором танина 1 : 20000 и сенсибилизируют растворимыми антигенами. После отмывания буферным изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитарный антиген готов к употреблению. Исследуемые сыворотки разводят изотоническим раствором хлорида натрия в пробирках или специальных пластмассовых пластинках с луночками, затем к каждому разведению сыворотки добавляют эритроцитарный диагностикум. Результаты реакции непрямой гемагглютинации учитывают по характеру осадка эритроцитов, образовавшегося на дне пробирки. Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки. При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска или «пуговки» располагаются в центре дна пробирки.

 

Реакция торможения гемагглютинации (РГГА) принадлежит к серологическим реакциям иммунитета. В РГГА специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), лишают его свойства склеивать эритроциты

Реакция нейтрализации вирусов.   В основе реакции лежит  способность специфических антител крепко связываться с вирусом,  в итоге вирус не может адсорбироваться на чувствительных клетках и размножаться у них.

Для постановки реакции необходимое наличие вируса, сыворотки, которая содержит антитела, и биологического объекта, который выступает индикатором нейтрализации. Такими объектами могут быть в зависимости от вида вируса лабораторные животные, куриные эмбрионы, тканевые культуры.

 

 Иммуноферментный метод (ИФА). В иммуноферметных методах антиген взаимодействует с антителом, при этом один из реагентов связан с энзимом. Для выявления этой ензимной метки необходимый соответствующий субстрат (хромоген), который реагирует в месте соединения антигена с антителом с мобилизованным ферментом, изменяя окраску реагирующей смеси.(рис. 26, 27.).

Для такой метки широко используется фермент – пероксидаза хрена, которая в зависимости от субстрату дает разноцветные продукты реакции.

Различают прямые и непрямые иммуноферментные методы.

Прямой метод. На первом этапе реакции антиген реагирует с антителом, меченым пероксидазой, потом к образованному комплексу добавляют соответствующий субстрат (например, Н2О2 и 5-аминосалицилову кислоту). 

Непрямой метод. Сначала антиген  реагирует с антителами, образовывая комплекс антиген – антитело, после промывания в систему вносят противоглобулиновые антитела, меченые пероксидазой, которые связываются с первым комплексом. После следующего промывания  вносят субстрат, который, разлагаясь адсорбируемым энзимом, предопределяет появление соответствующей окраски.

Иммуноблотинг. Для проведения иммуноблотинга исследуемые антигены сначала разделяют с помощью элетрофореза в геле. Полученные фракции электрофоретически переносят на листок нитроцеллюлозы (блот), который находится в специальной камере. Фиксированные блоты обрабатывают специфическими к антигену антителами, отмывают и добавляют радиоактивно меченный коньюгат для выявления антител, которые связались с антигеном.(рис. 28, 29)

После повторного промывания листок нитроцеллюлозы размещают в кассете с рентгеновской пленкой для радиоаутографии. На проявленной пленке появятся полосы локализации антигена, который связал меченые антитела.

Вместо радиоактивной метки можно использовать люминесцентные антитела или антитела, коньюгированные с ферментом. В последнем случае субстрат для энзима (хромоген) должен быть предварительно нанесенный на нитроцеллюлозную мембрану.

Вирусы (лат. virus — яд животного происхождения) — мельчайшие организмы, которые по своей морфологии, биологическим свойствам, химическому составу и способу размножения отличаются от других микроорганизмов. Вирусы являются строгими (облигатными) внутриклеточными паразитами и не размножаются вне живых клеток. Размеры вирусов очень малы: от 25 до 250 нм, их определяют размерами пор фарфоровых фильтров, через которые они проходят при фильтрации. Существуют мелкие вирусы: полиомиелита, ящура, желтой лихорадки, размер которых до 25 нм, и более крупные: вирусы оспы и осповакцины, размер которых приближается к 250 нм. Самые крупные мантийные вирусы — орнитоза, трахомы и венерической лимфогранулемы — имеют размер до 300—350 нм. Однако их химический состав сложнее, чем у остальных вирусов. Поэтому мантийные вирусы выделены в особую группу микроорганизмов «хламидозоа», или хламидии (по классификации Берджи группа 18).Изучение формы вирусов и их строения возможно только в электронном микроскопе при увеличении в 50 000—300 000 раз. Крупные вирусы размером более 150 нм можно увидеть в обычном световом микроскопе при специальных методах окраски и увеличении в 900— 1000 раз.
Форма вирусов может быть различной: шаровидной, овоидной, палочковидной, нитевидной, многогранной и булавовидной

Зрелые частицы вируса называют вирионами. Вирион состоит из нуклеиновой кислоты, заключенной в белковую оболочку — капсид. Тип и свойства нуклеиновой кислоты имеют важное значение в классификации вирусов. Характерными признаками вирусов является содержание в вирионе только одной из нуклеиновых кислот: либо ДНК, либо РНК- Все остальные живые организмы содержат одновременно и ДНК, и РНК. В зависимости от типа нуклеиновой кислоты вирусы можно разделить на две большие группы: ДНК-содержащие и РНК-содержащие. Нуклеиновая кислота вирусов может состоять из одной нити (однонитчатая) или двух нитей (двунитчатая). Почти все РНК-содержащие вирусы имеют в своем геноме однонитчатую РНК. ДНК-содержащие вирусы чаще имеют двунитчатую ДНК и редко — однонитчатую.

У многих вирусов нуклеиновая кислота и белок (нуклеопротеид) находятся внутри вириона (сердцевина — core), а у некоторых вирусов нуклеиновая кислота непосредственно заключена в капсид (нуклеокапсид). Капсид состоит из повторяющихся белковых субъединиц, которые образованы одной или несколькими белковыми молекулами. Группы из нескольких белковых молекул можно видеть на электронных микрофотографиях. Такие структурные единицы, образующие часть капсида, называют капсомерами. Способ укладки капсомеров (тип симметрии) и количество их в капсиде неодинаковы у разных вирусов. Капсомеры могут быть уложены в капсидах в виде многогранника с равными симметричными гранями (кубический тип симметрии) или по спирали (спиральный тип симметрии). Спиральный тип симметрии имеют вирусы гриппа, а кубический — адено-, герпес- и энтеровирусы. Вирусы с кубическим типом симметрии называют также изометрическими. У вирусов группы оспы и бактериофагов сложный тип симметрии: например, головка бактериофага кубического типа, а отросток- хвост— спирального

Многие вирусы животных и человека обладают внешней оболочкой (пеплос), окружающей их капсид. В состав этих оболочек входят липиды или липопротеиды. Наличие внешних оболочек характерно для вирусов, созревание которых происходит на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны клетки хозяина. Проходя через поверхность пораженной клетки, вирусный капсид как бы обволакивается этой мембраной, формируя один или несколько слоев своей внешней оболочки. Внешнюю оболочку имеют миксо-, герпес- и рабдовирусы (вирус бешенства), а также тогавирусы (вирусы энцефалитов). Внешние оболочки этих вирусов, содержащие фосфолипиды, разрушаются эфиром, что служит отличительным признаком от вирусов, которые имеют голый капсид. Вирусы группы оспы также имеют внешние оболочки, но формирование их происходит внутри пораженной клетки и к эфиру они нечувствительны. У некоторых вирусов (миксо- и тогавирусы) из внешнего липидаого слоя выступают наружу вирусспецифические гликопротеиды. Эти выступающие капсомеры называют шипами (пепломеры), хотя концы их не острые, а тупые.

Мелкие вирусы, имеющие форму палочек или шариков, могут образовывать упорядоченные структуры в виде кристаллов. Кристаллы состоят из сотен миллиардов вирусных частиц, тесно прижатых друг к другу.

Вирусы оспы, бешенства, хламидии трахомы и некоторые другие, поражая различные клетки организма, образуют в них внутриклеточные включения. Это крупные и плотные гранулы, которые при определенной окраске могут быть обнаружены в световом микроскопе. Внутриклеточные включения располагаются в ядре клетки или ее цитоплазме. Происхождение их пока неясно.

В одних случаях они являются внутриклеточными колониями (скоплениями) элементарных частиц вируса (вирионов), в других — продуктами реакции клетки хозяина на внедрившийся вирус. Обнаружение внутриклеточных включений при некоторых инфекциях служит диагностическим признаком заболевания: например, тельца Негри при бешенстве, тельца Гварниери при оспе.

  Вирусы составляют самостоятельное царство Vira, которое отличается от животных и растений тем, что в составе вириона находится только одна из двух нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), отсутствуют клеточные структуры и автономный обмен веществ и вирусы имеют репродуктивный способ размножения, возможный только в живой клетке

Международный комитет по таксономии вирусов (МКТВ) на III Международном конгрессе вирусологов (Мадрид, 1975) произвел группирование вирусов в роды и семейства на основании морфологии вириона, химического состава вирусов, характера репродукции их. Основные признаки, на которых базируется классификация вирусов:

1) характеристика нуклеиновой кислоты; тип (ДНК,РНК), число нитей в ней (одно- или двунитчатая), процентное содержание ее в вирионе, молекулярная масса, содержание гуанина и цитозина;

2) морфология вириона, тип симметрии, наличие внешних липопротеидных. оболочек, форма и размер вириона;

3) биофизические свойства вирусов и их химический состав (белки, липиды);

4) особенности репликации вирусов. Большое значение также придают устойчивости вируса к физическим и химическим факторам, кругу поражаемых хозяев и антигенным свойствам вирусов. Как «вид» предложено рассматривать набор вирусов, имеющих сходные характеристики. Род — группа видов с определенными общими свойствами, а семейство — группа родов, имеющих общие свойства.

Все изученные в настоящее время вирусы сгруппированы в 14 семейств, помимо которых существует группа неклассифицированных вирусов, например вирус гепатита А (возбудитель инфекционного гепатита) и вирус гепатита В (возбудитель сывороточного гепатита).

  Фаги представляют собой мельчайшие частички, или корпускулы, состоящие из головки и хвоста (отростка), по форме напоминающие сперматозоид. У некоторых фагов отросток очень короткий или совсем отсутствует. Размеры фагов варьируют от 20 до 200 нм: диаметр головки достигает обычно 60—95 нм, длина отростка 250 нм, ширина 10—25 нм. Как и вирусы, фаги имеют наружную белковую оболочку и заключенную в головке нуклеиновую кислоту. У большинства фагов это двунитчатая ДНК, Однако обнаружены фаги, имеющие однонитчатую

ДНК и даже РНК. Размеры молекулы ДНК во много раз превышают величину самого фага.

Наиболее изучены фаги кишечной палочки, имеющие сложное строение. Они состоят из головки, имеющей вид многогранника (кубический тип симметрии), и отростка — полой жесткой трубки, окруженной чехлом с капсомерами спирального типа укладки. На конце отростка имеется базальная пластинка с отходящими от нее нитями (рис. 27).

 

По химическому составу частицы бактериофага являются нуклеопротеидами и состоят на 50— 60% из белка и на 40—50% ДНК.

 

Фаги обладают специфичностью, которая заключается в их способности размножаться и вызывать лизис только бактерий определенного вида или типа. Различают моновалентные фаги, которые лизируют культуру бактерий определенного вида, и типовые фаги, лизирующие отдельные штаммы или варианты внутри одного и того же вида. Существуют и полифаги, которые могут вызывать лизис клеток родственных видов бактерий. Свойства специфичности фагов используют при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний.

 

Фаговые частицы, размножаясь в бактериальных клетках, засеянных сплошным газоном по поверхности плотных питательных сред, лизируют их и образуют «стерильные пятна». Такие пятна называют негативными колониями фага. У разных фагов они имеют строго определенную форму на микробном газоне: правильно округлую, звездчатую (дизентерийный фаг). Негативные колонии фага могут быть полностью прозрачны или состоят из прозрачного центра и мутной периферической зоны. При добавлении фага к жидким питательным средам, где культивируются чувствительные к нему бактерии, среда, бывшая до того мутной, просветляется.

 

Устойчивость фага к внешним воздействиям достаточно велика. Он устойчив к обычно используемым концентрациям дезинфицирующих веществ: 1—2% раствору фенола, 0,5% раствору сулемы, 1,5% раствору лизола. Отмечено даже привыкание фага к азотной и серной кислотам. Он выдерживает нагревание до 70—75°С. Тем не менее образование фага задерживают цитраты и оксалаты, рентгеновские и ультрафиолетовые лучи. Угнетающе действуют на фаг стрептомицин и полисахариды— гликоген и крахмал. В организме фаг сохраняется 10—13 дней.

 

Происхождение и природа фага до сих пор остаются неясными. Живую природу фага доказывают его способность к размножению за счет бактерии-хозяина, приобретение устойчивости к воздействию внешних факторов, способность изменяться и давать продукцию энзимов (ферменты). О происхождении фагов имеются два мнения:

1) фаг является экзогенным паразитом бактерий, существующим за счет перехода от одних бактерий к другим (болезнь бактерий);

2) фаг имеет эндогенное происхождение из бактерий и представляет собой одну из форм их развития. Предложена и компромиссная точка зрения: фаги произошли из фильтрующихся форм бактерий — эндогенно, но после обособления стали паразитами бактерий.  Реакция агглютинации

Реакция агглютинации (agglutinacio — склеивание) внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также частиц с адсор­бированными на них антигенами под влиянием антител в среде с электролитом. Реакция протекает в две фазы. В первой фа­зе происходит специфическая адсорбция антител на поверхности клетки или частицы, несущей соответствующие антигены, во второй — образование агрегата (агглютината) и выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролита (раствор хлорида натрия). Реакция агглютинации недостаточно специфична и чувстви­тельна. По данным признакам она уступает другим серологи­ческим реакциям (преципитации, связывания комплемента и т. д.). Повысить специфичность и чувствительность реакции можно путем разведения исследуемой сыворотки до ее титра или половины титра. Титром сыворотки называется то ее максимальное разведение, в котором обнаруживается агглютинация антигена. Чем выше титр антител, тем достовернее результаты реакции. Чтобы дифференцировать причину положительной реакции (ранее перенесенная инфекция, вакцинация или текущее заболевание), оценивают динамику нарастания титра антител, которое наблюдается только при текущей инфекции.

При наличии у разных бактерий одинаковых или сходных групповых антигенов они могут агглютинироваться одной и той же антисывороткой, что затрудняет их идентификацию. В таких случаях применяют реакцию адсорбции агглютининов по Кастеллани. Данная реакция основана на способности родственных групп бактерий адсорбировать из антисыворотки только группо­вые антитела при сохранении в ней типоспецифических анти­тел. Полученные сыворотки называются монорецепторным и, так как содержат антителя только к одному определенному антигену. Они применяются для детального изучения антигенной структуры бактерий с целью определения их серовара

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: R

Реакция агглютинации латекса (РАЛ) Для постановки РАЛ используют сенсибилизованные частицы полистиролового латекса диаметром  0,5-1,2 мкм, которые в присутствии гомологичного иммунологического реагента (антигена или антитела) склеиваются. Эта реакция происходит достаточно быстро – на протяжении 2-7 мин, что позволяет ее применять как экспресс-метод выявления антигенов и антител. Нагруженные антителами частицы латекса широко используются для выявления антигенов вирусов и бактерий.

Нагружая латекс антигенами, можно определять наличие антител в сыворотке больного. Такую модификацию РАЛ используют для выявления противогриппозных, противокраснушных, протикоревых антител и т.д.

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: R

Рис. Проведение  реакции латекс-аглютинации

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: R

Рис. Механизм прямой и непрямой реакции иммунофлуоресценции.

 

Реакция коагглютинации (КОА) .Для постановки КОА  используют золотистые стафилококки (штамм Cowan 1). В клеточной стенке этих микроорганизмов содержится белок А, который имеет значительное родство к Fc фрагменту IgG человека и кролика. Поэтому молекулы IgG после адсорбции на стафилококках, которые имеют белок А, ориентированные в окружающую среду своими свободными Fab фрагментами, в которых находится активный центр антитела.

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: R

 

Реакцию ставят на стеклянных пластинках, смешивая одинаковые объемы (1-2 капли) исследуемого материала (кровь, моча, слюна, фильтраты фекалий и др.) и стафилококкового диагностикума. Смесь тщательно перемешивают  и через 2-5 мин. на тёмном фоне учитывают результаты.  На тёмном фоне должна четко будет просматриваться мелкозернистая агглютинация стафилококков.

 

Механизм реакции непрямой гемагглютинации

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: R

Реакция лизиса и связывание комплемента.

 

Для реакции лизиса необходимые антиген, антитело и комплемент. Антигеном могут быть микроорганизмы, эритроциты или другие клетки. Как антитело (лизин) используют специфическую сыворотку или сыворотку больного. В зависимости от того, против каких клеток направленное действие лизины, они имеют свои названия: против бактерий — бактериолизины, спирохет — спирохетолизины, эритроцитов — гемолизины, против других клеток — цитолизины. Комплемент при образовании комплекса клетка (антиген) — антитело, связывается с ним, активируется за классическим путем и вызывает растворение клетки. Без комплемента лизис клетки невозможен. Различают несколько реакций лизиса: бактериолиза, гемолиза, цитолиза.

 

Реакция связывания комплемента (РСК). Характерным отличием РСК от реакции агглютинации и преципитации есть участие в ней, кроме антигена и антитела, ингредиентов реакции гемолиза, которая выступает в виде индикаторной системы. Взаимодействие антигена с антителом не всегда предопределяет визуальные изменения, которые позволяют определить результат реакции. Однако известно, что при образовании комплекса антиген — антитело к нему всегда присоединяется комплемент. Если антиген и антитело не отвечают друг другу, то комплемент не связывается, остается свободным в системе. При добавлении комплекса эритроциты барана — гемолизины свободный комплемент, связываясь с ним, вызывает гемолиз эритроцитов. Этот принцип и положено в основу РСК. При соответствии антигена антителу с ним связывается комплемент. Чтобы убедиться в этом, добавляют эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. При отсутствии гемолиза заключают, что реакция положительная, при наличии гемолиза — реакция негативная.

 

Опытная система АНТИГЕН (Бактерия,  клетка,  вирус и т.д.)

КОМПЛЕМЕНТ

АНТИТЕЛО (сыворотка)  Комплемент связался  с комплексом антиген-антитело

Индикаторная  гемолитическая система

ЭРИТРОЦИТЫ БАРАНА  (АНТИГЕН)

ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СЫВОРОТКА (АНТИТЕЛО)

Комплемента нет — связался с опытной системой.  Без  комплемента  гемолиз эритроцитов       невозможен.

 

 

 

Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: Описание: immun40

Рис. РСК

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСОВ

В сыворотке крови иммунизированных людей или перенесших вирусное заболевание обнаруживают антитела, способные ней­трализовать инфекционность вирусов. Эти антитела обычно выявляются при смешивании иммунной сыворотки с соответст­вующим вирусом с последующим введением этой смеси воспри­имчивым лабораторным животным или заражением культуры клеток. На основании выживания животного в первом случае или отсутствия цитопатического действия вируса во втором су­дят о нейтрализующей активности сыворотки. Реакция широко применяется в вирусологии для определения вида (типа) воз­будителя и титра вируснейтрализующих антител.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на свойстве антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфическими антителами вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. РТГА ши­роко применяется для серодиагностики вирусных инфекций с целью обнаружения специфических антигемагглютининов и для идентификации многих вирусов по их гемагглютининам (анти­генам).

РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ МЕЧЕНЫХ АНТИГЕНОВ
ИЛИ АНТИТЕЛ

В настоящее время широкое применение получили сероло­гические реакции, в которых участвуют меченые антигены или антитела. К ним относятся реакции иммунофлюоресценции, ра­диоиммунный и иммуноферментный методы. По своей чувстви­тельности они превосходят все описанные выше серологические реакции.

Реакции иммунофлюоресценции (по Кунсу)

Для выявления микробных антигенов в тканях или патологи­ческом материале можно использовать меченую диагностическую сыворотку, содержащую антитела к определенным видам (ва­риантам) микроорганизмов (бактерий, вирусов и др.). Метку антител производят флюорохромами (изотиоцианат флюоресцеи-на и др.) — прямой   метод  Куне а.

В связи с трудностями приготовления широкого набора флюо­ресцирующих специфических сывороток более доступным являет­ся непрямой метод Куне а. Его постановка требует лишь одной флюоресцирующей сыворотки — антиглобулиновой, содержащей   антитела   против   кроличьих   глобулинов,   так  как большинство диагностических антисывороток приготовляется пу­тем иммунизации кроликов разными антигенами. При образо­вании комплексов антиген — антитело флюоресцирующие анти-глобулиновые антитела фиксируются на них. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики, который по своей чув­ствительности и специфичности не уступает другим иммунологи­ческим реакциям.

Радиоиммунологический анализ (РИА)

Характерной чертой радиоиммунологического анализа (РИА) является сочетание специфичности, свойственной иммунологичес­ким реакциям, с простотой и высокой чувствительностью оп­ределения. По сравнению с обычными иммунологическими ме­тодами преимущество РИА состоит в том, что отсутствует необ­ходимость оценивать протекающую реакцию по вторичным про­явлениям, таким как агглютинация, преципитация, лизис эритро­цитов.

В одном из вариантов РИА меченый и немеченый антигены конкурируют за ограниченное число участков связывания со спе­цифическими антителами. Для того чтобы происходило конку­рентное взаимодействие, должна существовать определенная степень родства между меченым и немеченым антигеном. После двух этапов инкубации антител сначала с исследуемым, а затем со стандартным меченым антигеном количество включившегося в состав иммунных комплексов меченого антигена будет обратно пропорционально количеству немеченого антигена в исследуе­мой пробе.

Твердофазный радиоиммунологический анализ. Многие поли­меры (полиэтилен, полипропилен, полистирол) обладают спо­собностью связывать антитела или антигены белковой природы. Связанный с твердой фазой комплекс антиген — антитело легко отделяется от несвязавшегося биологического материала и при этом обладает высокой стабильностью. Меченый антиген, необ­ратимо связываясь с фиксированными на матрице антителами, позволяет проводить высокочувствительный анализ биологичес­кого материла.

Методы с использованием твердой фазы (пластмасса, целлю­лоза, сефадекс) существенно упростили процесс и возможность автоматизации процедур.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Возможность использования ферментов в качестве метки в иммуноанализе обусловлена прежде всего их высокой катали­тической активностью, позволяющей с помощью соответствую­щих субстратных систем определить концентрации фермента в растворе на уровне 1СР15 моль/л и ниже. Принципиально решена

проблема введения ферментной метки в молекулы антигенов и антител.

Наиболее широкое применение находит твердофазный имму-ноферментный анализ (ИФА). Он основан на том, что белки прочно адсорбируются на пластинках, например из поливинил-хлорида. Один из наиболее распространенных на практике ва­риантов ИФА основан на использовании меченых ферментом специфических антител и иммобилизованных антител той же специфичности. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор с анализируемым антигеном. В процессе ин­кубации на твердой фазе образуются специфические комплексы антиген — антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют гомологичные антитела, меченные фер­ментом, которые связываются со свободными валентностями антигена в составе комплексов. После вторичной инкубации и удаления избытка этих меченных ферментом антител определя­ют ферментативную активность на носителе, величина которой будет пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.

При другом варианте ИФА к иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и удаления несвязавшихся компонентов с помощью меченных ферментом антивидовых антител выявляют специфические иммунокомплек-сы. Данная схема является одной из наиболее распространен­ных в ИФА.

С целью максимального упрощения использования ИФА разрабатываются так называемые «безреагентные» системы, в которых все необходимые компоненты иммобилизованы или импрегнированы в пористую поверхность. Для проведения анали­за необходимо только нанести на носитель образец и визуально наблюдать изменение окраски носителя, происходящее вслед­ствие образования продукта ферментативной реакции.

Области применения и чувствительность ИФА аналогичны РИА. Однако ИФА по сравнению с РИА обладает целым рядом преимуществ: не используются радиоактивные изотопы, стабиль­ность конъюгатов позволяет хранить их в течение длительного времени, измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне, результаты ИФА можно оценивать полуколичественно без применения аппаратуры (визуально). ИФА очень легко под­дается автоматизации.

 

 

 



Источник: intranet.tdmu.edu.ua


Добавить комментарий